外泌体是膜包围的胞外囊泡(EV),其直径大小从40纳米至160nm不等,外泌体所包裹传递的生物活性物质包括核酸(DNA,mRNA和微小RNA,长的非编码RNA),蛋白质,脂质和代谢物等。已有越来越多的证据表明,外泌体作为局部和全身细胞间通讯的介质,凭借它们在循环中的长半衰期且易于修饰的特点,可有助于疾病识别和对治疗反应的评估,并用于治疗目的。
尽管外泌体具有关键的生物学和转化意义,但仍然缺乏能够识别这种
EV 亚型的真正通用蛋白质生物标志物。美国德州大学MD安德森癌症中心
Raghu Kalluri课题组基于超稳定同位素标记细胞培养中的氨基酸(super-SUPER-SILAC)的无偏和定量蛋白质组学方法,同时结合了高分辨率质谱法(MS),共定量了1212种蛋白质,其中外泌体中普遍富集22种蛋白质、缺乏15种蛋白质。同时发现Syntenin-1蛋白普遍存在于不同方法分离的不同细胞/不同物种和生物流体的外泌体中,可作为外泌体的通用标记物。
图1:《使用定量蛋白质组学确定syntenin-1是外泌体的核心蛋白质组中最丰富的,并可以作为通用的生物标志物》,该研究成果发表在最新一期Nature cell biology (2021年影响因子/JCR分区:28.824/Q1)
下面我们着重介绍文章中使用的两种外泌体分离技术
– 密度梯度超速离心法(DGUC)及体积排阻色谱(SEC)。
不同细胞系来源的外泌体分离
培养的细胞在
PBS 中洗涤 3 次,随后在无血清培养基中分泌外泌体 48
h。收集血清饥饿细胞的条件培养基(conditioned
medium, CM),800 xg 5 min去除细胞,2,000
xg 10 min去除碎片。随后,在 0.2 μm 过滤瓶中过滤 CM。CM在 4°C 下在 SW32 Ti 转子(Beckman Coulter)中以 100,000 xg超速离心3 h。超速离心后,CM 被丢弃,外泌体沉淀重悬在 PBS 中。外泌体储存在-80°C 用于下游分析。
一. 密度梯度离心法(DGUC)
a. 密度梯度液准备
每个样品分为三份分别进行梯度离心(DG)。OptiPrep 梯度使用冰 PBS配置,即配即用,每个梯度使用以下百分比和体积:12%(2 mL)、18%(2.5
mL)、24%(2.5 mL)、30%(2.5 mL) 和 36%(2.5
mL)。将UC分离的外泌体(共1 mL,相当于约5 × 1011个外泌体)混合到 OptiPrep 培养基中,使其终浓度为 36%,装载在超速离心管(Beckman Coulter)的底部。随后分别将下一个梯度轻轻装载在底层之上。
b. 密度梯度离心 - 外泌体纯化
梯度溶液以 120,000 xg在 SW41
Ti 转子(Beckman Coulter)中超速离心15 h。第二天,从每个梯度中收集 12 个组分,每个组分 1 mL (F1–F12)。合并来自同一样品的三个同级组分,共 3 mL。随后,使用12倍稀释的冷 PBS洗涤,并在 SW32 Ti 转子(Beckman Coulter)中以 120,000 xg超速离心4 h。每个部分(F1-F12)重悬在PBS中并储存在-80°C备用。用western blot分析F1-F12以确定富含外泌体的部分。将富含外泌体的组分合并用于 MS 分析。
二. 体积排阻色谱分离 (SEC)
超速离心制备分离的外泌体(500 μL,相当于约2.5 × 1011外泌体)在 35 nm的 qEV 色谱柱(Izon SP5)中进行纯化。对于每个外泌体样品,使用 Izon 自动馏分收集器收集25个500 μL 的馏分(F1–F25)。每个分析的样品进行两次分离,合并等效馏分,弃空馏分。(对于每个细胞系,使用专用的色谱柱,最多使用五次。两次不同样品之间需将柱洗涤三次:一次使用 15 mL 1% Triton X-100,两次使用 15 mL 过滤后的 PBS。)
使用纳米颗粒跟踪分析(NTA),以确定富含外泌体馏分。富含外泌体的部分合并到样品 1 中,其余部分合并到样品 2 中。根据western blot分析结果,使用
Amicon Ultra-2 离心过滤装置对样品 1 和 2 进行浓缩。并使用富含外泌体的组分进行MS 分析。
图2:显示了来自14 种细胞系的蛋白质组分析中发现的丰富候选生物标志物,其中外泌体中普遍富集22种蛋白质、缺乏15种蛋白质,在来自不同细胞系的外泌体的蛋白质组中,syntenin-1 是始终丰度最高的蛋白质。此外,还在从不同物种和生物体液中回收的外泌体中发现了 Syntenin-1。
外泌体大量表达的通用生物标志物的鉴定具有直接和深远的意义,使研究界能够开发出更有效和更具体的基于生化的技术,用于外泌体的鉴定、表征和纯化。此外,普遍存在的蛋白质的功能研究可能会导致对控制外泌体生物学的基本机制的新见解,例如生物发生、循环中的生物利用度和细胞运输,该文章提供的广泛存在于外泌体的核心蛋白定量图谱可作为外泌体研究的参考资源。
参考文献:
Kugeratski,
F. G., Hodge, K., Lilla, S., McAndrews, K. M., Zhou, X., Hwang, R. F., ...
& Kalluri, R. (2021). Quantitative proteomics identifies the core proteome
of exosomes with syntenin-1 as the highest abundant protein and a putative
universal biomarker. Nature Cell Biology, 23(6),
631-641. doi: 10.1038/s41556-021-00693-y