病历介绍：

某高校一课题组涉及到人类样本，由于是第一次做关于人源样本，经查询资料得知外周血溶血后在FSC/SSC散点图上会出现淋巴细胞/单核细胞/粒细胞三群（图一），所以设计了健康人CD4/CD3双色实验来研究淋巴细胞预实验，但是在检测时却发现自己的结果与资料上的并不一样，淋巴细胞的群体特别大，而单核和粒细胞以及淋巴细胞中CD3+T淋巴细胞比例也不正常（图二），所以特来问诊，看问题出在哪里，应该如何改善？

小贝问诊答疑：

从图二结果来看，粒细胞和单核细胞群体已经出现，但是淋巴细胞群体却与一些碎片类非淋巴群体混杂在一起，并没有完整的分离出来，经过咨询后得知，仪器质控通过，状态稳定，但是样品在制备过程中，溶血效果并不好，还有大量的红细胞存在，所以在图二中P1门控圈定的并不是淋巴细胞群体，而是淋巴细胞与未溶血的红细胞以及碎片混杂在一起。正常情况下，仪器会通过自动阈值来切除多余的碎片信息，但是在样本质量不太好，比如这次的溶血不充分时，自动阈值时仪器并不能区分出目的信号与碎片，导致大量碎片信息出现，而本次实验设置正是使用了仪器的自动阈值（FSC）设置。（图四）

                                   图四

小贝处方：

1) 从以上分析，我们推荐在本次检测中，由自动阈值设置改为手动设置，发现通过手动切阈值后，碎片减少（图五），圈定的P1门里CD3+T淋巴细胞比例上升（2.89%到8.69%）（图六），但是仍不是理想结果；

2) 由于白细胞都是CD45+细胞，可以与非白细胞（红细胞）明显区分出来，而且淋单粒三群细胞CD45表达强度存在差异，所以建议在后续实验设计时加染CD45抗体，这样可以利用CD45/SSC来分析圈定淋巴细胞群体，保证结果的准确性（图七）；

                                                                                                                    图7

3) 即使加染CD45抗体，可以保证分析结果的准确性，但是如果还是以FSC切阈值仍是有大量碎片存在，影响分析结果的美观以及增加收样时间，我们可以由FSC改为CD45通道来切阈值，这样既可以保证完整的CD45+白细胞群体完整，又只有少量的碎片存在（图八）。

                                                                         图八

小贝福利：

CytoFLEX不仅可以单通道设置阈值，还可以双通道设置，提供and和or两种不同的双通道阈值设置，它们的区别是“and”的逻辑是两个通道的合并区，蓝色阴影区域的信号不采集；“or”的逻辑是两个通道的重叠区。可以根据需要来选择合适的阈值设置。

在数据采集过程种，点击 A 阈值设置按钮后，鼠标放置与要设置阈值的散点图上直接设置单通道（主阈值），或者点击右键出现阈值通道与逻辑选择对话框进行选择。或者在采集参数设置中的阈值板块进行设置。

双通道阈值设置时，“and”逻辑展示：两个通道阈值的合并区，浅蓝色阴影区域信号都不采集。

思维发散区：

提问：流式单标管的作用是为了调节补偿，那单标管的制备有什么注意事项，必须是样本加所染抗体吗？

大家可以根据自己所学流式知识思考一下，欢迎大家填表问答，我们将送出“磁性计时器“，答案下期公布。