NGS片段筛选宝典之——大片段去除秘技!

基于SPRI技术的AMPure XP纯化技术已经家喻户晓。该技术采用顺磁性的磁珠、选择性的结合特定大小的核酸,已广泛应用于NGS的纯化及片段筛选等领域。那么,如何做到精准、可重复的片段筛选呢?请看,NGS片段筛选宝典之:大片段去除秘技!

秘技一 选择合适的产品——SPRIselect!

家喻户晓的AMPure XP的设计功能是从PCR产物中纯化100bp以上的核酸片段。虽然已有大量试剂盒/论文提供了AMPure XP片段筛选的方法,但是贝克曼库尔特更推荐SPRIselect进行片段筛选,以获取精确结果。因为SPRIselect是针对精准片段筛选而优化的。

秘技二 采取合适的实验流程!

SPRI技术会优先将更大的片段结合在磁珠上。如果需要保留较小的片段,而去除更大的片段,那么在SPRIselect试剂与待筛选溶液混合后,通过磁力架保留上清、弃去磁珠。较大片段会留在磁珠上;上清中包含有所需的较小片段,可通过再次加入SPRIselect试剂(更大的终浓度)将其充分回收。具体流程如下图所示。

 

秘技三 使用正确的浓度!

SPRIselect的浓度(指反应的终浓度)越高,越有利于更小片段在磁珠上的结合。

如果想要去除溶液中的大片段核酸,可通过控制SPRIselect加入的量,来控制保留在磁珠上的片段大小。
如下图所示。


 
M=Marker
Shear=1μL of 20ng/μL标准品水溶液
1.2x to 0.4x=1μL 经不同浓度SPRIselect筛选后的标准品。该浓度指第一轮加入SPRIselect试剂的比例。第二轮SPRIselect试剂统一使用1.8X来充分回收上清中的小片段。

那么,加入的SPRIselect体积是如何计算?


第一轮(吸附大片段)和第二轮(吸附上清中的小片段)加入磁珠的算法有什么差异?

例如使用0.7x来去除50μL核酸里>600bp的片段,需要:

  • 第一轮加入‘0.7x’的SPRIselect,即向样品中加入35μL的磁珠(50μL*0.7=35μL),共85μL。
  • 第二轮加入‘1.8x’的磁珠至上一步的上清:所需SPRIselect的体积=最初的样品体积* (1.8x– 第一轮磁珠比例),即50μL*(1.8–0.7)=55μL。

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