引言

肥胖诱发的慢性炎症（又称继发性炎症，meta-inflammation）会影响代谢器官中的免疫应答，从而导致脂肪肝和2型糖尿病。为了研究这些变化，荷兰莱顿大学医学中心的用户开发了一套30色光谱流式抗体组合方案，用于分析鼠源肝脏和白色脂肪组织中的免疫细胞，重点聚焦于巨噬细胞亚群及其活化状态。本研究在CytoFLEX LX流式细胞仪上，利用CytoFLEX mosaic光谱检测模块评估了OMIP-104方案的表现，重点评估了该方案在肝脏样本中的方案移植便捷性、panel性能表现以及自体荧光处理能力。

方法

本研究将OMIP-104方案中描述的样本制备与染色方法应用于另一批独立实验组小鼠的样本上。实验组小鼠饲喂含有60%热量来源高脂并添加1%胆固醇的西式饲料，从雄性小鼠肝脏中分离出经磁珠分选富集的CD45+细胞。在本次测试中，将六只不同小鼠的白细胞混合在一起作为一个样本进行分析。有关样本制备、抗体染色以及单染对照制备所用方法的详细说明，请参阅参考文献1中引用的补充材料部分。

结果

图1：相似性矩阵。本方案所用选定荧光染料的相似性矩阵复杂度评分为11.0，该图使用CytExpert for Spectral软件生成

图2：光谱预览。使用CytExpert for Spectral软件生成的荧光染料组合光谱图

图3：设门策略。A) 设置时间门以验证采集稳定性（未展示）。随后首先排除碎片、排黏连，死细胞，接着将总组织白细胞鉴定为CD45+CD31-。如图所示，鉴定出所有主要免疫细胞群及其相关亚群。B) 荧光减一 (FMO) 对照。针对活化标志物LipidTOX Deep Red、CD63–AlexaFluor 700、CD9–APC-Fire750、CD36–BV570、CCR2–PE-Cy5和TREM2–PE进行了FMO对照检测。样本在总巨噬细胞 (Mph) 门上进行预设门，如 (A) 所示。FMO对照以橙色显示，染色样本以蓝色显示。该图使用Cytobank数据分析平台生成

图4：应用多种自体荧光特征的光谱解混。A) 使用1种独特自体荧光特征对同一份样本进行解混的示例。B) 使用4种自体荧光特征对同一份样本进行解混的示例。数据分析在如图3A所示的总白细胞门上进行预设门。该图使用Cytobank分析平台生成

结论

尽管OMIP-104方案最初并非为CytoFLEX mosaic光谱检测模块设计，但可以轻松移植到该平台检测。使用CytoFLEX mosaic光谱检测模块，我们成功鉴定出了所有关键的免疫白细胞群。针对CytoFLEX mosaic模块对该方案进行专门优化（例如，通过重新滴定抗体以及增加适配808 nm激光器的荧光染料），可以进一步提升其性能。这为将其他仪器平台的抗体组合方案应用于CytoFLEX mosaic光谱检测模块奠定了可靠基础。

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参考文献：

1. Lambooij JM, Tak T, Zaldumbide A, Guigas B. OMIP-104: A 30-color spectral flow cytometry panel for comprehensive analysis of immune cell composition and macrophage subsets in mouse metabolic organs. Cytometry. 2024;105(7):493–500.