腺相关病毒（AAV）

是基因治疗中强大的递送载体。然而，在AAV组装时，其包装核酸序列的效率很低，导致只有一小部分病毒颗粒携带目标基因。富集纯化这些正确组装的病毒颗粒是下游纯化工作流程中的关键步骤。15-60% w/v的碘克沙醇（IDX）不连续密度梯度离心是一种成熟的从细胞裂解物中纯化AAV衣壳的主要方法。在实验过程中，铺设碘克沙醇不连续密度梯度是一项费力的工作，并且可能因操作人员的技能水平而导致结果的不稳定性。

为了应对这一操作难题，我们开发了这套OptiMATE全自动密度梯度分液系统的自动化解决方案。该系统消除了梯度液制备中的手动步骤，包括准备储备试剂、分液和离心管密封。OptiMATE可运行已建立的成熟方案，具有更高的一致性、准确性和易用性。

我们列出了OptiMATE自动化制备标准的IDX不连续梯度液的完整体系。同时，手动铺设了相同梯度层的梯度液，并从以下几方面进行对比：

• 离心管可变性；
• 梯度液折射率；
• 铺设梯度液操作时间；
• vgs回收率。

方法

表1：用于进行IDX对照研究的离心管溶液组分

血清型2  AAV通过三重转染在HEK-293细胞中进行表达后。裂解细胞并离心以去除碎片。然后，使用类似于梯度分析实验的15-60%（w/v）IDX不连续密度梯度液（表1，图1）纯化含有AAV的裂解澄清物。在自动组中，使用OptiMATE将IDX不连续密度梯度液分配到39 mL聚丙烯快封管中。每个离心管中加入2.08×1012病毒基因组（vgs）的AAV。在手动组中，使用OptiMATETM IDX制备IDX储备溶液（15%、25%、40%和60%），然后使用注射器和钝头针头通过底层法将每层梯度液分配到离心管中。自动组制备的离心管在仪器上自动进行密封，而手动组制备的离心管用无线热封器手动封口。在Optima XPN-90超速离心机中，使用Type 70 Ti转子中于16 °C下以63,000 rpm（407,427 xg）将离心管离心2小时。离心后，通过侧面穿刺提取AAV条带（在40%-60% IDX界面处），并使用离心旋转过滤器进行缓冲液替换。通过qPCR（AAVPro滴定试剂盒，Takara Bio）对vgs进行定量以评估回收率。

图1：全自动（上）与手动（下）配置15-60% w/v IDX不连续密度梯度液的AAV纯化方案对比

结果

我们通过离心管的总重量和使用折射仪测量梯度液的折射率来进行对比评估。测量的离心管总重量结果表明，自动化分液和密封后,离心管之间的可变性较低（表2）。尽管手动分配的离心管的可变性也较低，但如果操作人员技能不足，可变性可能会加剧。

图2显示了离心管中梯度液的密度与累积体积的关系。与手动的IDX不连续梯度液相比，OptiMATE分配的IDX不连续梯度液具有较高的准确性、更清晰的界面，并且保持在移液误差允许的范围内。两种方法中都存在一些层间扩散，这可归因于界面混合和分液过程引起的扩散。

表2：手动分液和OptiMATE自动分液的离心管重量对比。误差值为标准偏差（n=6）

图2：比较OptiMATE（红色）和手动流程（蓝色）配置的梯度液的密度曲线分布情况。基于预期移液误差的不同IDX层的预期密度理论曲线也被展示出来（浅灰色框）。绿色框标记AAV衣壳在曲线上的预期位置（在40-60% w/v界面处）。误差范围为标准差（n=3）

图3比较了手动和使用OptiMATE制备离心管的时间。不考虑数学计算或方法创建所花费的情况下，使用OptiMATE制备两个39mL快封管的速度明显比手动快。虽然OptiMATE的总时间为31分钟，手动为19分钟（多39%），但人工操作时间从手动的31分钟减少到OptiMATE的仅需5分钟（减少84%），这突显了人员时间和精力的大幅减少。随着离心管数量的增加，手动铺设和自动铺设之间的时间差异将进一步扩大，这也再一次凸显了OptiMATE系统并行分配和密封离心管的优势。

图3：使用OptiMATE或手动铺设两根39毫升快封管的IDX不连续密度梯度液示意图。制备步骤为浅灰色，分液和密封步骤为深灰色

为了评估AAV纯化效率，从离心管中回收含有AAV2样品的条带，使用qPCR分析条带中填充衣壳的含量（表3）。两种纯化方法回收的AAV量相差不大，并且与IDX不连续梯度液纯化的预期值匹配。由于该纯化的主要目标是在初步纯化步骤中将AAV2衣壳与细胞杂质分离，而不是区分空衣壳和完整衣壳，因此我们仅专注于比较vgs的回收率。

表3：纯化回收后的AAV2的qPCR分析结果

结论

OptiMATE可精确分配不连续梯度液，解决了密度梯度超速离心中的两个主要挑战：劳动强度和一致性。

• 梯度液的一致密度分布和纯化后AAV2 vgs的回收率共同证明了这一点。
• 操作界面简洁方便搭配自动化和精确性的使用流程，即使是新用户也能快速轻松的进行样品纯化。
• 设置和操作更加快速简化了整个工作流程，同时降低了操作人员接触化学和生物材料的风险。
• 此外，该仪器可无缝集成到现有的纯化过程中，降低了铺设高质量不连续密度梯度液的门槛，并提高了整体流程的效率。