AAV以其结构简单、无包膜的特性，以及在安全性、宿主细胞范围广泛和外源基因表达持久性方面的优势，已成为体内基因治疗的主流载体选择。然而，AAV的生产不仅产生含有治疗性DNA的完整包装颗粒，还伴随着产品相关杂质和过程杂质的生成。产品相关杂质包括空壳病毒、不完整包装病毒或DNA错误包装病毒等，这些杂质由于与完整包装颗粒具有相似的表面和颗粒特性难以完全去除，常存在于最终产品中。

空壳率作为AAV基因治疗产品关键质量属性之一，中国国家药品监督管理局在2023年发布的《腺相关病毒载体类体内基因治疗产品临床试验申请药学研究与评价技术指导原则》中，建议选择高分离度、性能稳定的分析方法用于空壳率等产品相关杂质的检测。《Proposed DRAFT Guidance for FDA Consideration… 》Draft Guidance推荐使用AUC进行放行检测。AUC-SV技术以其在原始缓冲液条件下无与伦比的分辨率和灵敏度已成为AAV产品杂质检测的金标准。AUC-SV能够基于沉降系数的不同，区分并量化AAV中的空壳病毒颗粒、部分包装病毒颗粒、完整包装病毒颗粒、病毒聚集体和病毒碎片等。空壳病毒颗粒通常具有60-65S的沉降系数，这一特性使得AUC-SV能够准确判断并量化这些杂质。此外，通过260nm和280nm波长的检测，根据响应值差异，AUC-SV能够识别空壳峰，利用其吸收信号值的比值可进一步定量确认空壳峰和完整包装AAV峰。AAV的表观沉降系数与核苷酸数（nt）的线性相关性，为完整包装颗粒的沉降系数提供了计算依据，从而综合实现对每个峰的专属性判断。

AAV的AUC检测结果示意图

（左：AUC-SV 在230nm典型检测结果图；右：通过260和280nm进行专属性确认）

BS-AUC在AAV检测中的应用

AUC-SV虽然具有良好的分辨率和灵敏度，但样品消耗量较大。带沉降分析超离心（BS-AUC）提供了一种替代方案，又称为合成边界实验（Synthetic boundary experiments），它使用特殊的中心件和毛细管，通过低转速下的扩散过程，实现高分辨率分离，同时显著减少样品消耗量。Takahiro Maruno等人的研究表明，BS-AUC能够有效地用于AAV的沉降分布分析和空壳率检测，利用PBS/H2O₁₈能够高分辨率地测定BS-AUC中各组分的浓度。与AUC-SV相比，BS-AUC在260 nm检测时可以使用约1/25的AAV载体量，在230 nm检测时可以使用约1/50的AAV载体量，这为AAV的鉴定方法提供了进一步的选择。

BS-AUC实验示意图

DGE-AUC在AAV检测中的应用

密度梯度平衡分析超速离心（DGE-AUC）是一种根据重力-浮力密度分离混合物中溶质的方法，它以高灵敏度和简便性著称。DGE-AUC能够用于不同密度的生物样品如空和完整包装病毒的高分辨率分析，且样品需求量极低。DGE-AUC在AAV的质控方面的应用正在逐渐优化。与AUC-SV相比，DGE-AUC实验具有高分辨率、高灵敏度的优势，并且样品需求量少，预计未来在AAV和其他AdV领域的应用将更加广泛。

AAV的方法学验证，涉及专属性、重复性、准确度、线性、耐用性等内容，可重点参考《Methodological Validation of Sedimentation Velocity Analytical Ultracentrifugation Method for Adeno-Associated Virus and Collaborative Calibration of System Suitability Substance》进行方法学验证。

通过这些技术的灵活应用，AAV载体的空壳率这项关键质量属性预期将得到有效控制，这为基因治疗产品的安全性和有效性提供了有力保障。随着AUC技术的不断发展和优化，预计将AUC在未来的AAV研究和应用中将发挥更加关键的作用。

推荐阅读及参考文献：

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