慢病毒与慢病毒载体|慢病毒浓缩与纯化|小贝学习中心

慢病毒的浓缩与纯化

在前两期的干货分享中，小贝已经为大家介绍了腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）的纯化方法。除了这两种病毒外，慢病毒也是实验室中经常用到的一种主流的病毒载体系统，并且具有其独特的优势与特点。今天小贝就给大家分享一下慢病毒的浓缩与纯化。

慢病毒与慢病毒载体

慢病毒属于逆转录病毒科，包括8种能够感染人和脊椎动物的病毒，原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，感染个体最终发病。慢病毒感染患者早期很难观察，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此称为慢病毒（Lentivirus）。慢病毒通常与免疫系统和中枢神经系统的慢性疾病有关，如人类免疫缺陷病毒（HIV）会导致艾滋病。

慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，对其自身元件进行改造而发展起来的一类能够携带外源基因的病毒载体。根据来源，主要有HIV-1、HIV-2、SIV等不同类型，其中HIV-1型载体系统应用最为广泛。

慢病毒载体的应用

与其他病毒相比，慢病毒有其独特的优点：

宿主更广泛
对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率。
稳定表达
慢病毒基因组可整合于宿主基因组，因此可以长时间、稳定表达外源基因。
可携带大约5kb或更长的外源基因片段

基于慢病毒载体的优点，其被广泛应用于RNAi、基因治疗以及转基因动物等研究中。体外构建能够表达siRNA的慢病毒载体，然后进行细胞转染，使其在细胞内转录siRNA，可发挥长期阻断基因表达的作用。同时，以慢病毒作为基因载体的多种基因疗法已在国内外开展临床研究，效果非常理想，在基因治疗中拥有广阔的应用前景。

慢病毒的浓缩与纯化

当使用慢病毒载体感染细胞时，通常需要浓缩病毒颗粒以获得高滴度，特别是需要感染大量细胞或者用于某些对转导具有抵抗力的细胞系时。离心是浓缩慢病毒载体的一种简单有效的方法，这里我们介绍两种常用的浓缩慢病毒载体的方法。

PEG浓缩法

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一种无电荷的线性分子结构的多糖，为乙二醇的聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离，使病毒聚合在一起，提高病毒的相对浓度，达到沉淀浓缩的目的。

基本流程：

1. 收集病毒上清液，使用0.45 μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片。
2. 将上清液与40% PEG溶液混合（可使用PEG8000、4000或6000），最终PEG浓度为10%。冰上放置3到6小时。
3. 放于Avanti J-15R离心机中，2000 ×g 离心30 min。
4. 去掉上清，使用1/20原始样品体积的PBS缓冲液对离心后形成的沉淀进行重悬。
5. 为了进一步浓缩，将重悬后的病毒样品转移到已预先消毒的超速离心管（Ultra-Clear Tube #344058）中，并使用PBS缓冲液进行配平。（注：可选用无菌无酶离心管 #C14292）
6. 按次序将超速离心管放置于SW 32 Ti的吊桶中。
7. 将装有病毒样品的SW 32 Ti转头放置于Optima XPN-100超速离心机中，100,000 ×g（24,500 rpm）离心90 min。
8. 直接倾倒或使用移液器小心去除上清，注意不要将病毒颗粒倒出。
9. 使用PBS或其他病毒存储液重悬沉淀，并将所有管中的样品集中在一个离心管中。
10. 集中的病毒样品分装后，-80℃保存备用。

蔗糖垫液离心法

为更好地保持慢病毒载体颗粒形态与结构的完整性，超速离心浓缩时经常在管底加入蔗糖垫液，使病毒样品在到达管底时沉降减速或不形成沉淀。

基本流程：

1. 收集病毒上清液，使用0.45 μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片。
2. 在已预先灭菌的超速离心管（Ultra-Clear Tube #344058）底部小心加入3-5 ml 20%蔗糖垫液。
（注：可选用无菌无酶离心管 #C14292）
3. 小心地将病毒上清液加至离心管中蔗糖垫液上。
4. 将超速离心管配平后小心放入吊桶中。
5. 将装有病毒样品的SW 32 Ti转头放置于Optima XPN-100超速离心机中，4℃，125,000 ×g离心90 min。
6. 直接倾倒或使用移液器小心去除上清，注意不要将病毒颗粒倒出。
7. 加入PBS或其他病毒存储液重悬沉淀，可选择在4℃下溶解2小时，每20分钟轻轻震荡。
8. 对离心得到的病毒样品进行分装，-80℃保存备用。