随着病毒生物学的快速发展，越来越多种类的病毒载体成为各个实验系统（细胞、组织、动物模型等）的转运核酸的工具。不仅如此，病毒载体目前还被应用于疾病治疗的临床实验中。目前，应用最广泛的病毒载体系统包括腺相关病毒（AAV）、腺病毒（AdV）、慢病毒（LV）、逆转录病毒（RV）等。在上一期推送中，小贝为大家介绍了腺相关病毒载体的纯化方法，本期小贝继续分享干货，介绍重组腺病毒的经典纯化方法与操作流程。

什么是腺病毒？

腺病毒（adenovirus, AdV）是一个二十面体的无包膜双链DNA病毒，直径为70-90 nm，由252个壳粒构成，含有14种蛋白质。根据其是否能复制，将腺病毒载体分为复制缺陷型和复制型两种，目前复制缺陷型腺病毒载体更为常用，因为其安全性更好，载体自身的免疫原性更低。另外，重组腺病毒具有以下几个显著的优点：

• 感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；
• 感染效率高达 100%，全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；
• 对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；
• 进入细胞内并不整合宿主细胞基因组，无插入致突变性，安全性高；
• 能够有效增殖，容易制得高滴度病毒载体，操作方便。

图1. 腺病毒的基本结构与感染过程

腺病毒载体的应用

重组腺病毒载体系统在基础生命科学研究、基因治疗、疫苗等领域被广泛应用。

腺病毒载体可以使哺乳动物外源基因高水平表达，可表达出占细胞总蛋白30%的重组蛋白。基于此，在生命科学领域中，腺病毒载体常用于在体外培养的哺乳动物细胞中表达重组蛋白，避免这些蛋白在原核生物、真核生物、昆虫细胞中表达的弊端。

另外，重组腺病毒载体因其诸多优点而被广泛选择用于基因治疗中的转基因试验和重要感染性疾病及恶性肿瘤的疫苗研究，以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到病毒基因组中，将这些能表达抗原基因的重组病毒制成疫苗，接种后在机体大量表达保护性抗体，刺激机体产生免疫反应。目前，腺病毒载体在HIV疫苗研究中备受关注，另外我国腺病毒载体重组新冠疫苗也在进行研发与试验中。

如何得到高纯度腺病毒样品？

无论是基因治疗还是疫苗研制，培养得到腺病毒载体后都需进行分离纯化，去除样品中的细胞碎片、杂蛋白、血清等杂质。最经典的腺病毒纯化方法是氯化铯密度梯度离心：

实验仪器：

贝克曼库尔特Optima XPN-100 超速离心机；SW 28转子；SW 41转子；SW 28与SW 41转子所需超离管及适配器；50毫升尖底管；注射器

实验材料：

10 mM HEPES；2.2 M CsCl溶液；4.0 M CsCl溶液；饱和CsCl溶液（8.0 M）；PBS + 10%甘油

实验方法：

1. 按下图所示在SW 28转子的超离管（UC超净管，#344058）中制备氯化铯密度梯度液，并将包含腺病毒颗粒的上清加至梯度液上方。

图2. 氯化铯密度梯度液、 SW 28水平转子与Optima XPN-100超速离心机

2. 将样品放于Optima XPN-100超速离心机中，4℃，25000 rpm，离心2小时或过夜。离心结束后在2.2 M CsCl与4.0 M CsCl中间存在呈白色的腺病毒颗粒样品带。

3. 取样时，可以选择使用上排法（从管口上方吸取）或穿刺取样法。选择穿刺取样法时，使用注射器，将针头插入白色病毒带下方约0.5厘米的离心管中，向上轻推针头，取出腺病毒颗粒约2.5 ml，如下图所示。

图3. 超速离心后穿刺取样示意图

4. 将上一步得到的2.5 ml病毒样品与2.5 ml饱和CsCl溶液混合，然后加入到SW 41转子的离心管中（UC超净管，#344059）。并分别铺设2 ml的4.0 M CsCl与4 ml的2.2 M CsCl的梯度液。

图2. SW 41水平转子、氯化铯密度梯度液

5. 将样品放于Optima XPN-100超速离心机中，4℃，35000 rpm，离心3小时或过夜。离心结束后，病毒样品在2.2 M CsCl与4.0 M CsCl溶液中间。

6. 使用移液器或1毫升注射器吸出病毒样品。

7. 将得到的病毒样品放入透析袋，在PBS + 10%甘油中透析1-2个小时。

8. 第一次透析后，将缓冲液换为新鲜配置的PBS + 10%甘油，透析过夜。

9. 检测纯化得到的腺病毒样品滴度、活性等，然后置于-80℃存储。

*本文涉及产品仅用于科研，不用于临床诊断

参考资料：
1. http://commercial.dxy.cn/article/527634
2. http://www.bioon.com/z/beckman_celltherapy/download/3.pdf