近年来，基因编辑技术取得了重大突破，细胞治疗和基因治疗成为了许多以前无法治疗或难以治疗的疾病的治疗手段。除了前两期说到的慢病毒载体和腺病毒载体，腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一，其应用潜力已经在大量的临床和非临床实验中得到验证。这一期小贝将分析如何分离得到高纯度的AAV病毒颗粒。
什么是腺相关病毒？
腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科，单链DNA病毒，通常需要在辅助病毒（如：腺病毒、单纯疱疹病毒等）的辅助下才能发生产毒性感染，生成子代腺相关病毒。腺相关病毒具有安全性好、特异性强、递送效率高、长期有效等特点，已被广泛应用于基因治疗领域，在已获批准的基因治疗产品中已经证实了这些优点。
腺相关病毒载体生产后有哪些杂质？
目前，主要有三类生产重组腺相关病毒的方式，分别位三质粒共转染、稳定细胞株生产以及杆状病毒感染。三种生产方式得到的重组腺相关病毒颗粒都需要进一步纯化，去除工艺相关杂质和产品相关杂质。工艺相关杂质来源于制造过程例如细胞基质、细胞培养和发酵培养基组分等。产品相关杂质是指与其本身性质非常类似的杂质，例如空壳等包装缺陷的病毒、聚集体、降解产物等。无论是哪种生产方式，得到的重组腺相关病毒颗粒中通常都会包含没有装载核酸的空衣壳。这可能是由于组成腺相关病毒衣壳的三种结构蛋白在细胞内的比例波动较大，而且特定的衣壳蛋白的翻译后修饰可能会有所差异，这些复杂性促进了形成缺陷病毒的概率。
其中，空壳病毒的存在被认为是有害的，因为它们是不必要的潜在抗原物质的来源，可能诱导或提高衣壳触发的抗腺相关病毒先天和适应性免疫反应，因此在生产过程中去除空衣壳以及量化腺相关病毒制剂中空壳率的能力是任何腺相关病毒生产过程的关键要求。
如何分离纯化腺相关病毒病毒载体？
腺相关病毒病毒样品同时存在与细胞与培养上清中，为获得更好收率，可以将细胞和培养上清都收集下来。
收集连同培养基的细胞，使用Avanti J-15R离心机，200 ×g离心3分钟，分别收集培养基上清和细胞沉淀，将上清另外存放，并用PBS重悬细胞；
反复冻融或超声破碎将细胞裂解后离心，使用Avanti JXN-26高效离心机，10,000 ×g离心去除细胞碎片，收集细胞裂解上清。
PEG 8000沉淀上清中的病毒，并用0.45 μm过滤器过滤，得到包含病毒颗粒的滤液用于后续纯化。
分别配置15%、25%、40%、60%碘克沙醇溶液，然后将新鲜配置的不同梯度的溶液铺至超离管内；（每次使用均需新鲜配置，同时铺两个梯度溶液）
将收集得到的包含AAV病毒颗粒的上清液分别加至超离管中，加满后封口；
将超离管放置于贝克曼Type 70 Ti角转子中，然后将载有样品的转子置于超速离心机Optima XPN-100超速离心机中；69,000 rpm离心1h；(根据样品量也可选择SW 32Ti或SW 41Ti水平转子)
离心结束后，全颗粒AAV病毒样品在40%-60%之间，穿刺取样小心将样品取出。取出时注意，40%梯度液上方白色条带为空壳样品、蛋白等杂质，为保证分离效果不要吸到此部分溶液。
碘克沙醇密度梯度分离AAV病毒样品
将纯化得到的病毒样品进行超滤或透析，脱盐处理后即可得到AAV病毒颗粒。
为得到高纯度样品，可进行第二次的碘克沙醇密度梯度离心，进一步去除AAV空颗粒与细胞碎片。在第二次离心时，可使用30%、40%、60%的碘克沙醇溶液进行分离。
如何检测腺相关病毒病毒载体空壳率？
目前有多种方法检测空壳率，包括电子显微镜、qPCR/ELISA、光密度法等，但是这些方法都不能准确定量。分析型超速离心技术（AUC）依据空壳病毒与全病毒颗粒沉降系数的不同，可以精确测定产物种AAV病毒载体的空壳率，同时可以检测中间产物、病毒载体碎片、基因组碎片、病毒聚集体等。AUC已成为检测AAV病毒载体空壳率的“金标准”，被业内人士广泛认可。
AUC检测病毒载体空壳率
为了帮助研究人员高效分离病毒毒株与假病毒，病毒分离专家贝克曼库尔特推出病毒纯化专用的超离配置方案，致力于帮助客户解决病毒分离难题。
参考文献：
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*本文涉及产品仅用于科研，不用于临床诊断